一、研究背景

可降解医用金属材料中，镁合金由于其良好的力学性能及生物相容性在心血管领域备受关注，被视为永久性支架颇具前景的一种替代品。但其过快的降解速率及生物相容性不足一直是制约其临床应用的重大挑战。表面改性可以兼具提高其耐蚀性并赋予生物功能，然而目前镁合金表/界面性能调控涂层存在单一性能实现的问题，往往无法应对实际病变导致的复杂血管微环境。近年来，仿生内皮功能的概念发展迅速。其中，催化一氧化氮（NO）生成涂层呈现亮眼的效果，而NO已被证实是一种有效的抗血栓形成和抗内膜增生剂，可以抑制血小板的粘附活化、平滑肌细胞（SMCs）的增殖和迁移。受此启发，在内皮损伤或功能障碍的情况下，设计NO释放涂层被视为内源性NO产生受阻时的外在补救措施。过渡金属铜离子（Cu2+）可以催化内源性NO供体产生NO。透明质酸（HA）是内皮糖萼的一种重要组成成分，能够维持内皮糖萼层的稳态，与多种生物过程有关，如抗炎、抑制血小板粘附和血栓形成等，能够为内皮细胞提供适宜的生长环境。

为此，北京大学郑玉峰教授和郑州大学关绍康教授在镁合金表面设计了NO释放涂层，以实现快速高效的内皮化进程。首先利用配位化学方法合成DOTA-Cu络合物，然后将HA和DOTA-Cu络合物以酰胺共价作用固定在富氨基的氟化预处理的ZE21B合金表面，成功构建出仿生内皮糖萼层和Cu2+催化释放NO的双生物功能复合涂层（HA/DOTA-Cu）。该复合涂层有效提高了基体的耐腐蚀性，腐蚀电流密度较基体降低了两个数量级。涂层具有优异的血液相容性及细胞相容性，NO的释放使涂层表面黏附的ECs数量增加超2倍，SMCs数量减少近4倍。本研究将为镁基可降解金属的多组分表面改性提供新的解决方向。

二、图文导读

文章首先对各涂层样品进行了表面材料学性能的综合表征，包括表面形貌、截面形貌、表面粗糙度、润湿性、表面化学成分及组成等。如图1-3所示，HA/DOTA-Cu样品表面呈不规则聚集颗粒状。三组样品的涂层厚度在1.26-2.23 μm之间，均与基体紧密结合。HA/DOTA-Cu样品表面的粗糙度最大，Rq为223.33 ± 35.35 nm，与图1中SEM形貌相对应。粗糙度较大的HA/DOTA-Cu样品的水接触角为35.71 ± 5.83°，为利于细胞黏附的亲水性表面，其原因是HA和DOTA结构中存在大量亲水性基团-羧基和氨基。FTIR图谱中，与PDAD样品相比，HA/DOTA-Cu样品在1640 cm-1和1470 cm-1处的吸收峰归属于酰胺Ⅰ键的C=O伸缩振动和酰胺Ⅱ键的N-H变形和C-N伸展峰，表明HA和DOTA-Cu结构中的羧基与PDAD表面提供的氨基位点以肽键的结构缩合。XPS图谱中，F KLL (F1s)、N 1s和Cu 2p特征元素的出现也分别证明了MgF2、PDAD和HA/DOTA-Cu涂层的成功制备。

图1 样品的（A）表面和（B）截面形貌

图2 样品的（A）二维和三维形貌，（B）表面粗糙度和（C）水接触角

图3 样品的表面化学成分分析：（A）FTIR，（B）XPS，（C）元素含量图，HA/DOTA-Cu样品的

（D）C 1s和（E）N 1s高分辨谱图

采用电化学测试对样品在Hank’s溶液中的电化学行为进行了研究，如图4所示。与ZE21B合金相比，所有改性样品的阻抗弧半径明显增大，腐蚀电流密度（Icorr）均降低了两个数量级，表明改性后样品的耐蚀性能得到了明显提高。在Hank’s溶液中浸泡1天后，Cu2+含量为20.05 ± 1.20 μg/L，浸泡3天后，HA/DOTA-Cu样品依然保持一定的Cu2+释放能力（图4（D））。涂层在初始阶段释放一定量的Cu2+，有助于发挥生物学功能。血液相容性研究结果（图5）中，全血黏附结果表明HA/DOTA-Cu样品基本保持了涂层本身的形态，即不同尺度的颗粒聚集，没有各种细胞和活化的血小板。血小板结果中，PDAD样品表面吸附的血小板呈现铺展状态，且数量丰富，推测这种现象可能是由于PDAD样品表面含有丰富的氨基和相对粗糙的表面，此外，聚多巴胺对不同底物均具有优异的粘附性能，也会加剧血小板的粘附。而经HA和DOTA-Cu偶联后，表面吸附的血小板基本呈球形，无明显聚集，数量也明显低于其他组（图5（C）），表明该涂层抗血小板粘附能力明显提高，得益于带负电荷的HA抑制血小板黏附的作用。

图4 样品在Hank’s溶液中的电化学测试曲线：（A）动电位极化曲线，（B）奈奎斯特图，

（C）动电位极化曲线的拟合参数，（D）HA/DOTA-Cu样品在浸泡过程中Cu2+浓度

图5 样品表面（A）全血和（B）血小板黏附结果，（C）血小板数量的统计图

最后，对样品的细胞相容性进行了研究，如图6所示。与ZE21B合金相比，改性样品表面黏附的ECs密度显著增加，丝状伪足向各个方向伸展。HA/DOTA-Cu样品上黏附的ECs密度和扩散面积最高，固定化的HA使ECs分泌IV型胶原更加有序，与体内天然细胞外基质的分泌相似，且Cu2+的释放促进了ECs相关因子的表达。而NO供体存在时，HA/DOTA-Cu样品表面黏附的ECs数量是无NO供体组的2倍以上。ZE21B、MgF2和PDAD样品表面黏附的SMCs数量随着时间的推移而增加，在培养过程中没有明显变化（如图7）。而孵育72 h后，HA/DOTA-Cu样品表面大部分SMCs呈扁圆形，无长而窄的纺锤型肌动蛋白丝，SMCs的数量也低于其他各组，说明该涂层可以抑制SMCs的过度增殖。研究表明，Cu可以通过抑制i-κB-α的磷酸化来抑制参与SMCs增殖的NF-κB活化，因此，SMCs在HA/DOTA-Cu样品表面的增殖活性降低可能与Cu抑制NF-κB活化有关。NO供体存在时，HA/DOTA-Cu样品表面黏附的SMCs数量比无NO供体组减少近4倍，且SMCs形态呈变形皱缩状。图8的共培养结果同样表明，HA/DOTA-Cu复合涂层可以选择性促进ECs的黏附增殖，并抑制SMCs的病态增殖，NO的产生可以使此趋势更加显著。进一步，研究了不同条件下NO的释放情况，如图9（A），不同时间点，HA/DOTA-Cu组ECs的NO释放量最高（15.45 ± 3.07 μmol/L至48.95 ± 2.13 μmol/L），而ZE21B组的NO释放量最低。NO供体存在时，HA/DOTA-Cu样品表面NO浓度在1 h内达到15.93 ± 0.35 μmol/L（图9（B）），比无NO供体组高8倍，证明了该涂层原位催化生成NO的有效性。NO的短期及长期释放结果也表明HA/DOTA-Cu样品可以在一定时间内保持其催化生成NO的能力，表明涂层中固定Cu的稳定性。

图6 样品表面内皮细胞的黏附形态：（A）荧光染色图，

（B）HA/DOTA-Cu样品表面有无供体时内皮细胞的荧光染色图和数量统计图

图7 样品表面平滑肌细胞的黏附形态：（A）荧光染色图，

（B）HA/DOTA-Cu样品表面有无供体时平滑肌细胞的荧光染色图和数量统计图

图8 内皮细胞（绿色）和平滑肌细胞（红色）共培养的（A）荧光染色图和比例统计图

图9 NO释放行为：（A）样品表面培养内皮细胞时NO的释放量（无NO供体），

（B）有无NO供体时HA/DOTA-Cu样品表面培养内皮细胞时NO的释放量

，HA/DOTA和HA/DOTA-Cu样品在NO供体存在时（C）短期和（D）长期NO的释放量

三、结论与展望

综上所述，本文提出了一种新的接枝策略，在可降解的ZE21B合金表面制备了具有NO生成和类内皮糖萼双重生物功能的涂层。与ZE21B合金相比，HA/DOTA-Cu复合涂层不仅提高了基体的耐腐蚀性，而且显著改善了其血液相容性，包括抑制血小板的粘附及激活，并降低了溶血率。在NO供体作用下，通过Cu2+的催化，连续生成的NO分子有效地发挥了其生理作用。HA/DOTA-Cu复合涂层中HA提供的类内皮糖萼微环境及释放的NO分子能够协同促进ECs在材料表面的黏附和增殖，同时抑制SMCs的过度增殖。总之，本研究的内皮仿生设计为血管支架的表面改性提供了新的解决方案，对心血管植入物表面改性具有较大的应用潜能。

四、文章信息

该文章发表在《Journal of Magnesium and Alloys》2023年第11卷第12期：

[1] Qianying Jia, Qinggong Jia, Shijie Zhu, Yufeng Zheng*, Yoji Mine, Kazuki Takashima, Shaokang Guan*. A promoting nitric oxide‐releasing coating containing copper ion on ZE21B alloy for potential vascular stent application [J]. Journal of Magnesium and Alloys, 2023, 11(12): 4542-4561.

五、中文摘要

作为心血管支架，镁基可降解金属显示出许多优异的性能，已被用于治疗冠状动脉心血管疾病。然而，降解速度过快、生物相容性不足及延迟再内皮化等问题仍然是其应用中面临的重大挑战。在本工作中，为了克服这些缺点，一种催化一氧化氮（NO）释放的含Cu2+化合物和透明质酸（HA）被共价固定在富含氨基的氢氟酸（HF）预处理的ZE21B合金表面，用于提高ZE21B合金的耐蚀性和内皮化功能。具体地说，Cu2+与环1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N, N′， N′′， N′′′ -四乙酸（DOTA）螯合形成稳定的化合物，以避免Cu2+的爆释。螯合的Cu2+催化NO的生成，可以在血管微环境中促进内皮细胞（ECs）的黏附和增殖。这样，NO的生成与内皮糖萼分子HA的协同作用有效促进了ECs的增殖并抑制了平滑肌细胞（SMCs）的增殖。同时，样品的血液相容性也取得了明显的改善。电化学测试表明，功能化的ZE21B合金具有较好的抗腐蚀能力。综上所述，该双功能复合涂层在可降解镁基心血管支架植入领域具有广阔的应用前景。

六、英文摘要

Magnesium-based biodegradable metals as cardiovascular stents have shown a lot of excellent performance, which have been used to treat coronary artery diseases. However, the excessive degradation rate, imperfect biocompatibility and delayed re-endothelialization still lead to a considerable challenge for its application. In this work, to overcome these shortcomings, a compound of catalyzing nitric oxide (NO) generation containing copper ions (Cu2+) and hyaluronic acid (HA), an important component of the extracellular matrix, were covalently immobilized on a hydrofluoric acid (HF)-pretreated ZE21B alloy via amination layer for improving its corrosion resistance and endothelialization. Specifically, the Cu2+chelated firmly with a cyclen 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-N, N′, N″, N″′- tetraacetic acid (DOTA) could form a stability of hybrid coating, avoiding the explosion of Cu2+. The chelated Cu2+enabled the catalytic generation of NO and promoted the adhesion and proliferation of endothelial cells (ECs) in vascular micro-environment. In this case, the synergistic effect of NO-generation and endothelial glycocalyx molecules of HA lead to efficient ECs promotion and smooth muscle cells (SMCs) inhibition. Meanwhile, the blood compatibility also had achieved a marked improvement. Moreover, the standard electrochemical measurements indicated that the functionalized ZE21B alloy had better anti-corrosion ability. In a conclusion, the dual-functional coating displays a great potential in the field of biodegradable magnesium-based implantable cardiovascular stents.

七、作者简介

第一作者/通讯作者简介：

贾倩影（第一作者），大连理工大学工学硕士，郑州大学材料科学与工程学院工学博士，主要研究方向为生物医用材料的表面改性。

郑玉峰（通讯作者），北京大学教授、博士生导师、材料科学与工程学院生命健康材料研究所所长，国家杰出青年科学基金获得者、教育部长江学者特聘教授、科技部中青年科技创新领军人才、中组部万人计划入选者、国际生物材料科学与工程学会联合会“生物材料科学与工程”会士、美国医学与生物工程研究院会士、中国生物材料学会会士。作为项目负责人，先后承担十四五、十三五国家重点研发计划项目、国家自然科学基金重点项目等纵向课题与横向课题50余项，发表英文SCI论文600余篇，被引用47000余次，H-index为104，科睿唯安2022/2023年全球高被引学者，获授权发明专利50余项。

关绍康（通讯作者），博士/二级教授，国务院政府特殊津贴专家。2016-2022年任郑州大学副校长，现任河南省先进镁合金重点实验室主任、中国材料研究学会镁合金分会副理事长，中国生物医学工程学会介入医学工程分会主任委员、中国生物材料学会心血管材料分会荣誉主任会员等职务。承担国家“863”等重点研发项目近30项，发表SCI论文212篇，授权国家发明专利35件；获河南省自然科学一等奖、中国有色金属科技进步一等奖等多项奖励。