01 论文概述

镁基生物材料由于其优异的机械特性和能够促进骨骼生长的特性，数十年来一直被广泛应用于骨科领域。然而，镁基生物材料的快速降解又限制了其临床应用。迄今为止，目前高纯镁都比超高纯镁的长期腐蚀速率更高。然而超高纯度镁的价格昂贵。为了降低成本，研究人员使用了许多工艺方法来去除镁及镁合金的杂质，如过滤、真空蒸馏、使用助熔剂等。因此，迫切需要开发一种简易的工艺，以提高镁的纯度和可降解性能。

近期，印度坎普尔理工学院Ashok Kumar教授等人通过重复铸造法制备了高纯镁，再将羟基磷灰石和锶掺杂羟基磷灰石纳米颗粒通过搅拌和挤压铸造的方法加入到纯镁之中。研究结果表明，羟基磷灰石和锶掺杂羟基磷灰石纳米颗粒的添加成功增强了该高纯镁的性能，促进了晶粒细化，提高了耐腐蚀性、生物相容性和机械性能，使得降解速率均匀且可控。组织学测试证实在植入钉周围有新骨形成，且没有观察到不良反应，验证了其在体内的生物相容性。

本研究通过湿化学沉淀法，自主合成了粒径均为50-60 nm的羟基磷灰石（HAP）和锶掺杂羟基磷灰石（SrHAP，Sr摩尔分数为5%）纳米颗粒，如图1a和b所示。这些类骨磷灰石纳米颗粒被用作P-Mg合金的增强相。前期研究已经表明，掺杂高浓度的羟基磷灰石可以加速镁基体的降解速率。因此，在本研究中，选取羟基磷灰石和锶掺杂羟基磷灰石纳米颗粒的浓度均为0.666 wt.%，并分别命名为P-MgHAP和P-MgSrHAP。如图1所示，添加羟基磷灰石和锶掺杂羟基磷灰石纳米颗粒到P-Mg中会使合金获得更高的抗压强度和延伸率，其最后的压缩模量（UCM）也会显著增加，从189 MPa增加到248 MPa和262 MPa。与P-Mg相比，P-MgHAP和P-MgSrHAP的延伸百分比增加了近一倍。研究结果表明，将羟基磷灰石和锶掺杂羟基磷灰石纳米颗粒加入到P-Mg中可以有效改善其抗压性能。同时断裂应变的增加表明在表明室温下其塑性和成形性得到了提高。图1e显示了P-Mg、P-MgHAP和P-MgSrHAP的拉伸应力-应变曲线。与SrHAP相比，P-Mg的拉伸强度在添加HAP后显著增强。添加SrHAP后，P-Mg的拉伸强度和延伸性均下降，表明其脆性增加。

图1 合成的(a)纳米羟基磷灰石（HAP）和(b)锶掺杂纳米羟基磷灰石（SrHAP）纳米颗粒的扫描电子显微镜图像；(c)为X射线衍射图谱显示HAP，SrHAP，P-Mg，P-MgHAP和P-MgSrHAP的特征峰；(d)和(e)分别为P-Mg，P-MgHAP和P-MgSrHAP的压缩和拉伸应力-应变曲线

随后进行生物相容性测试，可以观察到提取物对细胞增殖和存活的影响与浓度有关。在最高浓度（100%）下，所有提取物均会导致细胞死亡，而随着浓度的降低，观察到在72小时后细胞存活率增加（图2a-c）。此外还记录了提取物的pH值，发现P-Mg的pH值为10.0，P-MgHAP和P-MgSrHAP的pH值分别为8.5（图2d）。

图2 通过MTT法间接细胞培养测定，测定了由(a) P-Mg，(b) P-MgHAP和(c) P-MgSrHAP提取物制备的提取物在24和72小时内的细胞增殖情况。图(d)显示了由P-Mg，P-MgHAP和P-MgSrHAP提取物制备的不同提取物的pH值

通过基于显微CT获得的图像可以计算出体内降解速率（mm/年），该速率是基于植入物前后的体积差异（图3d）。在所有样品组中，与P-MgSrHAP相比，P-Mg显示出明显更高的体内降解速率。与P-Mg和P-MgHAP相比，P-MgSrHAP的尺寸/结构变化非常小（图3a-c）。纳米水泥的吸收速度的缓慢与P-Mg的快速降解之间存在直接的关联，因为降解产物会大量释放，完全打破了骨重塑过程，最终影响了骨细胞对纳米水泥的吸收。此外，镁离子释放会导致的骨重建失衡，也降低了成骨细胞的活性，从而减少了整骨的形成，并影响其骨愈合。

图 3 (a) P-Mg; (b) P-MgHAP 和(c) P-MgSrHAP。(d) 从微CT扫描获得的图像计算得出（d）P-Mg，P-MgHAP和P-MgSrHAP的体内降解速率（mm/年）

通过去除植入物后对脱钙样品进行定性组织学分析，以评估植入物周围的骨形成情况。H&E染色（图4）显示，空白组和纯镁组在缺损部位周围和内部都没有新骨形成。然而在所有其他组，在合金植入时加入NC（双相纳米水泥） + ZA（唑来膦酸），植入物周围的新骨形成更良好，残留的纳米羟基磷灰石清晰可见。植入物周围有新骨形成，这显示出植入物与宿主骨骼结合良好。全组植入8周后的H&E染色结果显示，在与NC + ZA一起植入针的组中，小梁型骨在植入针的外围清晰可见，显示出骨整合（虚线红框）。羟基磷灰石残留物（灰色）在P-Mg + NC + ZA组中也可见，表明材料吸收不完全，因此新骨的形成较差，相比之下，P-MgHAP + NC + ZA组和P-MgSrHAP + NC + ZA组的新骨形成更好。

图4 全组植入8周后的H&E染色结果

综上所述，本研究采用简单的重复铸造方法，实现了99.9%的高纯镁的制备。羟基磷灰石和锶掺杂羟基磷灰石纳米颗粒成功添加进入高纯镁基体中，促进晶粒细化，改善了耐腐蚀性、生物相容性并提高了力学性能。镁合金呈现出均匀和可控的降解速率。组织学测试证实了植入物的侧面有新骨形成，并未观察到不良效应，验证了在小鼠体内的生物相容性。并且，所有植入材料都表现出可控的降解速率，其作为临时骨科植入固定器具有广阔的应用前景。

02 文章发表

该文章发表在《Journal of Magnesium and Alloys》2023年第11卷第1期：

[1] Shaikh Shazia*, Qayoom Irfan, Sarvesha R, Kumar Ashok*. Bioresorbable magnesium-based alloys containing strontium doped nanohydroxyapatite promotes bone healing in critical sized bone defect in rat femur shaft [J]. Journal of Magnesium and Alloys, 2023, 11 (1): 270-286.

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04 中文摘要

镁基生物材料由于其优异的机械特性和能够促进骨骼生长的特性，数十年来一直被广泛应用于骨科领域。然而，镁基生物材料的快速降解又限制了其临床应用。在本研究中，采用熔融自净化的方法对镁进行了提纯（P-Mg），并通过搅拌辅助挤压铸造方法，加入纳米羟基磷灰石（HAP，0.6 wt.%）和锶掺杂纳米羟基磷灰石（SrHAP，0.6 wt.%）纳米颗粒，以控制其降解速率。通过电子背散射衍射（EBSD）和X射线衍射（XRD）检测，对所有铸造材料进行了微观结构和相分析。还对制备的合金进行了力学特性、体外降解和体外与小鼠成骨前成熟细胞生物相容性测试。为了对骨形成、骨整合以及降解速率进行检测，将镁基合金制备成直径为2.7 mm、高度为2 mm的小圆柱销钉。将销钉植入大鼠股骨干，并通过显微CT和组织学检测骨生长和骨整合的情况。显微CT和组织学分析显示，与P-Mg和P-MgHAP相比，P-MgSrHAP组在植入物周围新骨形成最快以及骨整合最良好。当使用GIXRD法分析从小鼠体内中取出的销钉时，显示出了羟基磷灰石峰。在植入8周后，根据显微CT得出合金在小鼠体内的降解速率，P-Mg、P-MgHAP和P-MgSrHAP分别约为0.6 mm/年、0.5 mm/年和0.1 mm/年。P-MgSrHAP具有均匀可控的降解速率以及良好的力学和生物性能，表明其有潜力用于制造可降解的骨科植入物。

05 Abstract

Magnesium-based biomaterials have been in extensive research for orthopedic applications for decades due to their optimal mechanical features and osteopromotive nature; nevertheless, rapid degradation restricts their clinical applicability. In this study, pristine magnesium was purified (P-Mg) using a melt self-purification approach and reinforced using indigenously synthesized nanohydroxyapatite (HAP, 0.6 wt.%) and strontium substituted nanohydroxyapatite (SrHAP, 0.6 wt.%) using a low-cost stir assisted squeeze casting method to control their degradation rate. Using electron back-scattered diffraction (EBSD) and X-ray diffraction (XRD) examinations, all casted materials were carefully evaluated for microstructure and phase analysis. Mechanical characteristics, in vitro degradation, and in vitro biocompatibility with murine pre-osteoblasts were also tested on the fabricated alloys. For in vivo examination of bone formation, osteointegration, and degradation rate, the magnesium-based alloys were fabricated as small cylindrical pins with a diameter of 2.7 mm and a height of 2 mm. The pins were implanted in a critical-sized defect in a rat femur shaft (2.7 mm diameter and 2 mm depth) for 8 weeks and evaluated by micro-CT and histological evaluation for bone growth and osteointegration. When compared to P-Mg and P-MgHAP, micro-CT and histological analyses revealed that the P-MgSrHAP group had the highest bone formation towards the periphery of the implant and hence maximum osteointegration. When the removed pins from the bone defect were analyzed using GIXRD, they displayed hydroxyapatite peaks that were consistent with bio-integration. For P-Mg, P-MgHAP, and P-MgSrHAP 8 weeks after implantation, in vivo degradation rates derived from micro-CT were around 0.6 mm/year, 0.5 mm/year, and 0.1 mm/year, respectively. Finally, P-MgSrHAP possesses the requisite degradation rate as well as sufficient mechanical and biological properties, indicating that it has the potential to be used in the development/fabrication of biodegradable bioactive orthopaedic implants.