摘    要

大多数急性缺血性中风患者，尤其是大血管阻塞的患者，需要支架植入以实现完全再通。然而，由于缺血-再灌注损伤，超过一半的这些患者的预后仍然不佳。因此，神经保护治疗对于缓解缺血性脑损伤至关重要，并且进行了一项“生物可降解神经保护支架”的概念验证研究。这一概念基于这样一个假设：血液中局部释放的来自镁金属的Mg2+/H2可以为远离的脑缺血组织提供协同神经保护，以防止再灌注损伤。研究首先评估了纯镁在氧-葡萄糖剥夺/再氧化（OGD/R）受损神经元细胞中的神经活性潜力。随后，将纯镁丝植入到暂时性大脑中动脉闭塞（MCAO）大鼠模型的颈总动脉中，以模拟人类脑缺血/再灌注损伤。体外分析显示，纯镁提取物帮助小鼠海马神经元细胞（HT-22）防御OGD/R损伤。此外，证实了镁丝对MCAO大鼠的行为异常、神经损伤、血脑屏障破坏和脑血流减少具有保护作用。总之，基于镁的生物可降解神经保护植入物可以作为一个有效的局部Mg2+/H2输送系统，用于治疗远离的脑缺血性疾病。

1. 引言

长期以来，急性缺血性中风（AIS）的有效神经保护一直是困扰临床医生的难题。由于缺血/再灌注（I/R）损伤，超过一半的患者在再通治疗后仍然面临不良预后。其中，颅内动脉粥样硬化引起的大血管阻塞占AIS病例的15-35%，大多数患者需要在血栓切除术后植入支架以实现完全再通。因此，将再通治疗与神经保护治疗相结合以减轻I/R损伤至关重要。能够产生和释放镁离子和氢气等神经保护剂的生物可降解镁金属，是制造神经保护性脑支架的有希望的候选材料。

镁离子补充可以通过三个主要机制减少脑缺血：减少细胞内钙超载、增强脑血流以及在脑缺血后维持能量代谢。通过近端动脉直接输注Mg2+到目标器官可以增强其神经保护效果，并最小化血脑屏障损伤。此外，氢气已被确定为一种神经保护治疗剂，可以防止氧化损伤。受2007年大田茂的关键研究影响，通过吸入、注射/输注和摄取给予H2已显示出对各种脑部疾病（包括I/R损伤、创伤性损伤和蛛网膜下腔出血）的显著治疗潜力。分子氢在缺血性中风患者中的安全性和有效性已得到探索。鉴于其高产氢能力（41.7 mmol/g），显著超过富氢饱和水（0.8 μmol/mL），镁可以作为长期的氢源。而且，最近的临床试验表明，Mg2+和氢气的组合治疗对脑部疾病具有协同保护作用。因此，基于镁的脑血管植入物可以作为局部Mg2+和H2输送系统，治疗AIS患者再灌注后的远程神经损伤。

镁及其合金作为生物可降解心血管支架（如DREAMS和DREAMS 2G支架）已被广泛探索，在BIOSOLVE-I和BIOSOLVE-II临床试验中显示出前景。这些发现为镁基合金作为脑血管支架植入物开辟了新的研究方向。然而，关于镁降解产物对神经系统的影响仍存在不确定性。在一项研究中，裸镁钕锌锆支架被植入健康新西兰白兔的颈总动脉20个月，未观察到包括大脑在内的主要器官中Mg2+离子积累。此外，一项体内研究涉及将镁锌合金板植入大鼠皮下以检查24小时内Mg2+平衡，结果显示健康大鼠大脑中的Mg2+水平未升高。尽管如此，鉴于病理条件下血脑屏障受损，血管中镁植入物降解产物对远程缺血性脑组织的潜在影响仍然不确定。

在本研究中，我们引入了“生物可降解神经保护支架”的创新概念，并假设血液中局部释放的Mg2+/H2从镁金属中可以协同保护远程的脑缺血组织。本研究的科学前提和实施方案如图1所示。为了验证这一假设，通过计算建模模拟了颈总动脉（CCA）中镁丝在血流下的腐蚀行为。随后，将健康和氧葡萄糖剥夺/再氧化（OGD/R）损伤的神经元细胞培养在镁提取物中，以评估其体外细胞相容性和神经保护特性。最后，将纯镁丝植入大脑中动脉闭塞（MCAO）大鼠模型的CCA中，以研究潜在的神经保护机制和体内腐蚀行为。评估了镁丝对行为、神经救援、血脑屏障（BBB）完整性和脑血流恢复的影响。此外，还进一步检查了镁丝植入对血液和脑组织中离子和分子浓度的时间依赖性影响。

图1. 生物可降解神经保护支架的概念验证及其实施策略。生物可降解神经保护支架指的是在血流中向受损脑组织输送时，能够在支架降解过程中局部产生神经保护物质（如Mg2+/H2）的支架，从而救援远端脑缺血组织。为了验证这一概念，采用了大脑中动脉闭塞大鼠模型，将代表镁支架的镁丝植入到颈总动脉中。

2. 结果

2.1. 镁丝在颈总动脉内腐蚀的计算模型

在任何实验程序之前，评估植入颈总动脉的镁丝的腐蚀行为以及Mg2+和H2随时间释放的情况是必要的。图2A展示了基于颈总动脉模型和材料植入的血管及插入镁丝的建模，以及相关的血流速度分布。植入后，镁丝周围的血流速率降低，但血管仍然保持开放。最快的流速出现在近端，其次是丝表面，远端流速最低，均略低于中心血流速率。图2B揭示了镁丝直径随时间的变化。由于均匀腐蚀，镁丝直径随时间线性减小，显示出约2毫米/年的腐蚀速率。图2B还展示了第7天丝表面上镁离子和氢气的释放浓度。镁丝近端的高流速引发了更高的腐蚀速率，导致Mg2+和H2浓度迅速初始增加。然而，随着丝长度的增加腐蚀速率降低，浓度增加的速度逐渐放缓，受到扩散机制的影响，这减少了镁丝表面上的表面浓度。最终，丝表面上的Mg2+和H2浓度迅速初始增加然后稳定下来。

图2. 颈总动脉内镁丝腐蚀的计算模型。(A) 血管和插入镁丝的建模，以及血管内相应的血流速度分布。(B) 计算得到的镁丝直径随时间的变化以及第7天丝表面周围释放的Mg2+和H2浓度。(C) 镁丝随时间的模拟形态特征及Mg2+浓度的轮廓图。

2.2. 体外细胞毒性和神经保护分析

继计算模型之后，对纯镁降解的细胞毒性和神经保护进行了体外评估。使用HUVECs、HASMCs和HT-22评估了对血管细胞和神经元的细胞毒性。首先，进行了CCK-8检测（图S1，A至C），显示不同浓度镁丝提取物对HUVECs、HASMCs和HT-22的体外细胞毒性最小。同时，活/死细胞染色加强了CCK-8的结果（图S1，D和E），表明与对照培养基相比，不同浓度的纯镁提取物并未改变活细胞比率。这些发现表明，镁丝降解过程中产生物质对血管和神经细胞没有毒性作用。

随后，评估了分级Mg2+的体外神经保护作用。采用OGD/R模拟体外I/R损伤。基于CCK-8和乳酸脱氢酶（LDH）释放实验结果，0.4至10 mM浓度的Mg2+似乎提供了神经保护（图S2）。考虑到镁离子的强大神经保护能力，进一步检查了镁提取物对神经元的影响。镁提取物含有高水平的Mg2+和H2，超过对照培养基的含量（图3A和B）。此外，Mg2+浓度处于神经保护范围内（图S2）。虽然Mg2+和H2都提供神经保护，但需要确认镁提取物中的Mg2+和H2的潜在协同神经保护效应。在本研究中，对镁提取物进行了超声波处理以去除H2，从而比较有无超声处理的神经保护效果。我们测量了提取液超声后的氢气含量，并确认氢气被完全去除。实验过程如图3C所示。

图3. 镁丝提取物对氧-葡萄糖剥夺/再氧化（OGD/R）损伤细胞的体外神经保护作用。(A) 通过气相色谱法检测H2的原始数据。(B) 在正常达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM）和浸泡镁丝的DMEM中H2和Mg2+的定量。(C) OGD/R细胞实验流程图。通过(D)细胞活力、(E)上清液中相对乳酸脱氢酶（LDH）释放浓度、(F)细胞内活性氧物种（ROS）的相对荧光强度以及(G)使用荧光显微镜拍摄的细胞内Ca2+的荧光图像来评估镁丝的神经保护效果，比例尺：20 μm。(H) 根据(G)计算的Ca2+荧光强度的定量。统计学显著性表示为* p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001对比OGD/R组；#p < 0.05, ##p < 0.01, ###p < 0.001。

首先，通过CCK-8测试评估神经元活力，通过LDH释放测试评估细胞死亡。经过OGD/R处理后，神经元活力显著降低，细胞死亡增加。这些神经元损伤指标被100%和50%镁提取物减少，但25%镁提取物没有减少。100%镁提取物的逆转效应超过了50%镁提取物。此外，尽管100%镁提取物经过超声处理后仍显示出神经保护作用，但其效果不如未经过超声处理的100%镁提取物。同时，50%和25%镁提取物经过超声处理后未显示出神经保护作用，与其未经过超声处理的对应物相比没有差异（图3D和E）。

由于H2是已知的活性氧物种（ROS）清除剂，而Mg2+是天然的钙拮抗剂，可抑制细胞内Ca2+过载，因此测量了细胞内ROS和Ca2+水平，以评估镁丝提取物的神经保护作用是否源于减少了细胞内ROS产生和Ca2+过载。经过OGD/R处理后，细胞内ROS和Ca2+水平均增加。有趣的是，不同镁丝提取物对细胞内ROS和钙的影响与它们对神经细胞的保护作用相呼应。100%和50%镁提取物，以及经过超声处理后的100%镁提取物显著降低了细胞内ROS和Ca2+。然而，25%镁提取物和经过超声处理的50%及25%镁提取物则没有。此外，100%镁提取物在抑制ROS和Ca2+方面比经过超声处理后的100%镁提取物和50%镁提取物更有效（图3F–H）。

结果表明，镁提取物提供剂量依赖性的神经保护作用，其神经保护效果源于Mg2+和H2对ROS产生和Ca2+过载的协同抑制影响。

2.3. 镁丝的体内神经保护作用

鉴于镁降解产物在体外表现出色神经保护作用，将镁丝植入大鼠CCAs中，在缺血后和再灌注开始时评估其对再灌注损伤的体内神经保护作用。同时，也植入了常用于支架制造的Ni-Ti丝作为对照，以评估外来物质对血流的影响，并将其神经效应与镁丝进行比较。纯镁丝的微观结构表征和机械性能分析如图S3所示。手术后一天，与假手术组相比，MCAO组表现出严重的神经功能缺损，MCAO + Ni-Ti组未见改善。然而，在MCAO + Mg组观察到显著的神经保护作用（图4A–C）。值得注意的是，MCAO + Mg组的Longa评分较低，表明大脑运动区域损伤减少（图4A）。升高身体摆动测试（EBST）评分也显示，与MCAO组和MCAO + Ni-Ti组相比，MCAO + Mg组的身体运动不对称性较低（图4B）。此外，转轮测试显示，植入镁丝的大鼠在MCAO后运动能力恢复改善，表现为跌落潜伏期增加（图4C）。尽管手术后一天未观察到差异，粘附去除测试显示，与MCAO组和MCAO + Ni-Ti组相比，MCAO + Mg组在手术后三天的传感器运动功能显著更好，表现为去除时间减少（图4D）。镁丝植入的神经保护效果持续了14天（图4A–D）。

图4. 缺血损伤后镁丝的体内神经保护作用。(A) Longa评分，(B) 升高身体摆动测试（EBST），(C) 转轮测试，和 (D) 粘附去除测试在手术前以及手术后1、3、5、7、10和14天进行。(E) 手术后7天进行了开放场测试。(F) 开放场中的行走距离和时间。每个组的样本量为假手术组n = 6，大脑中动脉闭塞（MCAO）、MCAO + Ni-Ti和MCAO + Mg组每组n = 12。统计学显著性表示为* p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001对比MCAO + Mg组与MCAO组；##p < 0.01, ###p < 0.001对比MCAO + Mg组与MCAO + Ni-Ti组。

手术后七天，进行了开放场实验（图4E）。MCAO + Mg组的总移动距离和持续时间超过了MCAO组和MCAO + Ni-Ti组，表明MCAO + Mg组有更大的自发运动参与度（图4F）。此外，MCAO + Mg组的大鼠在内部外围区域和中心区域的穿越次数更多，花费的时间也更长，这表明这些大鼠的卒中后焦虑减少（图4F）。因此，行为测试结果表明镁丝植入可以保留受损的神经功能。

2.4. 镁丝的体内脑部完整性效应

鉴于镁丝在体内具有积极的神经保护效果，手术后7天提取了大鼠的大脑进行体外组织学检查。首先，使用三苯基氯化四氮唑（TTC）染色评估了梗死体积。与假手术组相比，MCAO组显示出显著的梗死，而MCAO + Ni-Ti组对梗死区域没有影响。然而，镁丝植入表现出抑制效果（图5A和B）。接下来，使用了突出神经元中Nissl体的Nissl染色来评估神经细胞完整性。Nissl染色结果显示，在皮层和纹状体中，MCAO + Mg组的神经元完整性优于MCAO组和MCAO + Ni-Ti组（图5C和D）。

图5. 镁丝在缺血/再灌注损伤后7天内的体内脑部完整性和脑血流（CBF）保护效果。(A) 脑切片的TTC染色图像和(B) 梗死体积的半定量分析。(C) 脑切片的Nissl染色图像和(D) Nissl体的半定量分析；比例尺：1毫米和25微米。(E) 缺血大脑对侧和同侧的水含量比。(F) Evans蓝染料渗入大脑的代表性图像和(G) 梗死侧脑组织中Evans蓝含量的定量。(H) 通过激光散斑成像在指定时间点测量的大鼠CBF图像。(I) 从(H)派生的大鼠时间序列CBF曲线，损伤侧CBF表达为与对侧的比率。样本量对于假手术组为n = 5，对于大脑中动脉闭塞（MCAO）、MCAO + Ni-Ti和MCAO + Mg组为n = 6。统计学显著性表示为* p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001对比MCAO + Mg组与MCAO组；#p < 0.05, ##p < 0.01, ###p < 0.001对比MCAO + Mg组与MCAO + Ni-Ti组。

血脑屏障（BBB）破坏是缺血性中风的另一个常见后果，可能会恶化预后。BBB损伤允许水和其他有害大分子渗透到脑组织中。因此，测量了脑水含量和脑白蛋白浓度以评估BBB泄漏。如图5E所示，与MCAO和MCAO + Ni-Ti组相比，MCAO + Mg组在梗死半球的水含量较低。Evans蓝染色显示，通过BBB的白蛋白泄漏在MCAO + Mg组中少于MCAO和MCAO + Ni-Ti组（图5F和G）。这些脑部的组织学发现表明，镁丝可以有效地保存缺血/再灌注损伤后的脑部完整性。

2.5. 镁丝的体内脑血流效应

先前的研究表明，Mg2+和H2都可以在缺血/再灌注损伤后扩张血管。因此，监测了手术前、手术期间以及手术后1天和7天的脑血流（CBF）。最初，MCAO、MCAO + Ni-Ti和MCAO + Mg组的基线CBF一致。启动MCAO模型后，受伤侧的CBF下降到对侧CBF的约40%，并在30分钟再灌注后恢复到大约65%（图5H和I）。假手术程序和金属丝植入不影响CBF（图S4和S5）。再灌注后第一天，MCAO和MCAO + Ni-Ti组的CBF保持在约66%，而在MCAO + Mg组中，CBF显著增加到81.0%。此外，再灌注后7天，接受镁丝治疗的大鼠CBF恢复到95.8%，明显高于MCAO和MCAO + Ni-Ti组（图5H和I）。这些CBF结果表明，镁丝植入可能扩张脑血管，从而在缺血/再灌注损伤后增强CBF。